Ozonoterapia: prevenzione e trattamento della tossicità indotta dalla chemioterapia

La rivoluzione dell’ozonoterapia… . una sola frase che rende pienamente l’idea delle infinite possibilità di applicazione dell’ozono nelle malattie umane.

Le caratteristiche biochimiche e farmacologiche dell’ozono forniscono ragioni per considerare questa molecola utile nel trattamento di numerose infezioni virali (1a), in particolare nel trattamento del COVID-19.

L’ozono è un ossidante che mostra un’attività paradossale a contatto con molecole organiche, provocando così una potente risposta antiossidante (3a).

Infatti, reagendo con substrati target nei fluidi biologici (PUFA e GSH), porta alla creazione di idroperossidi e aldeidi.

Tra questi, il 4-HNE (4 idrossilnonenale) è un elemento chiave nella trasduzione del segnale, coinvolto nella sovraregolazione del glutatione e anche nell’aumento della resistenza all’apoptosi derivante da agenti pro-ossidanti.

Provoca una significativa risposta adattativa allo stress, stimolando l’espressione degli enzimi antiossidanti e disintossicanti.

Il 4-HNE parzialmente escreto dal fegato e dai reni, è per lo più attaccato alla molecola di albumina Cys 34, GSH e cisteina (4a).

Queste molecole attraverso la circolazione trasferiscono facilmente il 4-HNE nel citoplasma di molte cellule. Il citoplasma cellulare contiene un fattore di trascrizione inattivo chiamato Nrf2, legato a un fattore inattivo più grande contenente gruppi SH chiamato Keap-1, ricco di cisteina.

Quando è attaccato a Cys 273 o Cys 288 di Keap-1, 4-HNE rilascia la molecola chiave Nrf 2 (Fattore Nucleare Erythroid 2-Related Factor 2).

Ciò porta all’espressione di diversi enzimi antiossidanti: SOD, GPx, GST, CAT, HO-1, NQO-1, HSP e enzimi del metabolismo dei farmaci di fase II (4a).

HO-1 catalizza la degradazione dell’eme in monossido di carbonio (CO), che modula NF-KB determinando una diminuita espressione di citochine pro-infiammatorie e induzione diretta di citochine anti-infiammatorie.

L’ozono mostra un’azione antiossidante e antinfiammatoria, essendo agenti di trascrizione NF-KB e Nrf2 che modulano l’espressione genica delle citochine proinfiammatorie e antinfiammatorie.

L’accumulo di LOP e 4-HNE durante lo stress ossidativo e in presenza di malattia, genera un meccanismo di feedback che trasmette segnali e stimola reti in grado di fermare eventi di ossidazione critici, comuni a diverse condizioni.

Reagendo con PUFA e aldeidi, l’ozono genera idroperossidi e in particolare H2O2, si diffonde rapidamente attraverso le cellule del sistema immunitario.

Inoltre bioregola la trasduzione del segnale promuovendo così le risposte immunitarie, modulando l’interferone e le interleuchine attraverso l’attivazione di NF-KB, aumentando così il rilascio di citochine.

Questo processo fa parte di un sistema endogeno. Nel 2002 Lerner e Wentworth hanno sottolineato il fatto che il corpo umano è in grado di produrre ozono per proteggersi dagli agenti infettivi.

Ciò avviene coinvolgendo neutrofili e anticorpi del sistema immunitario che, producendo ozono, sfruttano il suo potere ossidante per distruggere batteri e virus presenti sulle pareti cellulari (5a-7a).

Tanaka ha dimostrato come i virus influenzali possano essere inattivati ​​da basse concentrazioni di ozono nell’ambiente e su superfici lisce.

Altri studi (3a-8a) hanno dimostrato che l’ozono può svolgere un ruolo determinante contro batteri , virus e malattie fungine.

Murray et al8 hanno evidenziato una diminuzione dell’infettività virale dopo l’esposizione all’ozono. Ciò provoca la perossidazione lipidica del virus capside, interrompendo così il suo ciclo riproduttivo, impedendo il necessario contatto tra il virus e il recettore.

Altri studi hanno dimostrato come l’ ozono possa inattivare i ceppi virali con o senza involucro (8a). Alcuni ceppi come HSV-1 (Herpes Simplex tipo 1 Mc Intyre) e VSV (Vesicular Stomatitis Virus Indiana) dopo essere stati ozonizzati hanno mostrato una riduzione di 6 Log 10 delle particelle infettive in 15 minuti.

I ceppi VAC (ceppo Elstree) e H1 N1 (influenza A), hanno mostrato una riduzione fino a 5 Log 10 rispettivamente in 40 e 30 minuti. Questi risultati mostrano importanti cambiamenti nella morfologia di diversi ceppi virali (8a).

Oltre all’azione antiossidante, antinfiammatoria e antivirale, possiamo considerare la rilevante attività di stimolazione e risposta immunitaria legata all’NFAT, fattore di trascrizione legato a diverse citochine (IL-2, IL-6, TNF-Alfa e IFN-Gamma) con il suo supporto ai linfociti e ai macrofagi, costituendo la prima linea di difesa.

Un’altra caratteristica importante dell’ozonoterapia contro l’infezione da COVID-19 è dimostrata dalla capacità di contrasto verso l’ipossiemia grave, tipica di questo virus.

I test effettuati mediante spettroscopia NIRS, hanno portato ad un aumento dell’ossigenazione (nel caso specifico cerebrale) evidenziato da un aumento dell’emoglobina ossigenata e valori costanti di quella non ossigenata.

L’ozono è una molecola che agisce su diversi livelli e in diversi campi fisiopatologici. Pertanto, riteniamo che sarebbe utile proporre questa metodica come supporto alla terapia farmacologica attualmente in trattamento contro le infezioni virali in generale ed in particolare contro COVID-19 e all’interno di un approccio di medicina integrativa (10a-11a).

Ora che abbiamo capito il meccanismo d’azione…. concentriamoci sulla possibilità di utilizzare l’ozonoterapia nel trattamento del cancro.

La chemioterapia (CT) è uno dei principali trattamenti per il cancro. La sua efficacia è cresciuta a causa dei nuovi agenti chemioterapici, dei nuovi regimi di combinazione e di un approccio multimodale in aumento.

Molti effetti della chemioterapia dipendono dall’aumento dei radicali liberi e delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) nelle cellule tumorali.

Tuttavia, possono anche mediare la tossicità indotta dalla chemioterapia (CIT). Per molti farmaci, le tossicità più frequenti e maggiori sono citopenie, nausea, vomito e perdita di capelli. Quest’ultimo è solitamente reversibile; per la gestione e / o la prevenzione delle citopenie, sono disponibili trasfusioni di piastrine o emoglobina, agenti stimolanti l’eritropoietina e fattori di crescita stimolanti le colonie (CSGF).

Tuttavia, alcune altre importanti tossicità possono colpire diversi organi e tessuti, a seconda dell’agente CT. Di solito questo danno è mediato da ROS e da un elevato stress ossidativo e spesso gli approcci preventivi e terapeutici sono limitati.

I ROS cellulari sono generati nei mitocondri dalla fosforilazione ossidativa. I ROS partecipano anche come molecole di segnalazione ai processi fisiologici cellulari di proliferazione e sopravvivenza. Pertanto, lo stress ossidativo riflette lo squilibrio dovuto a un eccesso di ROS o ossidanti che superano la capacità delle cellule di esercitare risposte antiossidanti efficaci.

Un’eccessiva produzione di ROS può derivare dalla disfunzione dei mitocondri o dall’interazione tra una produzione mitocondriale normale o eccessiva con fonti esogene. L’anione superossido (O2 • -) è un radicale libero prodotto dalla riduzione di un singolo elettrone di O2.

È il primo ROS prodotto direttamente dall’O2 e il precursore di tutti gli altri ROS. Spontanea e superossido dismutasi (SOD) -dipendente O2 • – la dismutazione genera perossido di idrogeno (H2O2), che a sua volta può subire la reazione di Fenton per generare il radicale idrossile (OH •) in presenza di metalli di transizione, più comunemente Fe2 +.

Lo stress ossidativo provoca danni macromolecolari. La perossidazione lipidica genera prodotti diretti quali malondialdeide (MDA), isoprostani e 4-idrossinonenale.

L’ossidazione delle proteine ​​può causare la frammentazione dei residui amminoacidici, la formazione di legami crociati proteina-proteina e l’ossidazione della spina dorsale delle proteine.

Il danno ossidativo al DNA provoca alterazioni nelle basi del DNA. Inoltre, l’MDA può reagire con il DNA per formare addotti al DNA [1,2].

L’ozono (O3) è la forma allotropica triatomica dell’ossigeno che è molto reattiva (meno stabile) e più solubile (10 volte) in acqua e plasma rispetto alla forma allotropica biatomica (O2).

La sua potenza antiossidante è la terza dopo il fluoro e il persolfato ed è superiore all’O2 [3a]. L’ozono terapia consiste nell’utilizzo medico di una miscela gassosa di O3 / O2, ottenuta da ossigeno medicale mediante un dispositivo generatore di ozono e che deve essere somministrata in situ a causa della breve emivita (a 20 ° C la concentrazione di O3 viene dimezzato entro 40 min, a 30 ° C entro 25 min) [3].

Le concentrazioni cliniche tipiche di O3 variano da 10 a 60 µg / mL (µg di O3 / mL di O2) di una miscela O3 (0,5–0,05%) e O2 (95–99,5%) [4]. Quindi, sebbene più del 95% della miscela di gas sia sempre ossigeno, piccole variazioni nel contenuto di O3 cambiano i suoi potenziali effetti.

Una maggiore concentrazione di ozono (massimo 0,02 µg / mL) è benefica, poiché impedisce alla luce UV dannosa di raggiungere la superficie terrestre [5]. Tuttavia, l’esposizione per inalazione all’ozono troposferico prolungato danneggia il sistema respiratorio e gli organi extrapolmonari.

Allo stesso modo, nell’uomo l’ozono può essere pericoloso o benefico, a seconda della via e dell’organo / tessuto di somministrazione e della concentrazione di esposizione.

Sta diventando chiaro come il sistema respiratorio, sottoposto a stress ossidativo cronico, possa rilasciare lentamente, ma costantemente, un numero enorme di composti tossici in grado di entrare nella circolazione e causare gravi danni [6].

Inoltre, la potente capacità antiossidante del sangue esposto a una piccola e precisa dose di ozono solo per pochi minuti può modulare il sistema antiossidante endogeno e aiuta nel controllo di diverse condizioni patologiche [7].

Questa revisione si concentra principalmente su quattro farmaci: cisplatino, metotrexato, doxorubicina e bleomicina, che appartengono a diversi gruppi CT – agenti alchilanti, antimetaboliti e antibiotici antitumorali, rispettivamente.

Questi farmaci possono indurre una tossicità grave e dose-limitante, che è stata ridotta nei modelli sperimentali quando l’ozono è stato somministrato come approccio preventivo o terapeutico. Successivamente verranno riassunti alcuni lavori correlati a supporto degli studi precedenti.

Tossicità indotta dalla chemioterapia e radicali liberi

I mitocondri sono uno dei principali contributori allo sviluppo e alla progressione del cancro.

La maggior parte dell’O2 • generato in condizioni fisiologiche viene efficacemente convertito in H2O2 dalla superossido dismutasi (SOD). La catalasi, la glutatione perossidasi (GSH-Px, otto isoforme) e le perossirossine (Prxs, sei isoforme) possono convertire H2O2 in acqua e O2. Anche la reazione O2 • – a H2O2 avviene spontaneamente.

Piccole concentrazioni di ROS sono necessarie come messaggeri e segnali per una regolazione cellulare appropriata. Livelli più elevati di ROS e radicali liberi sono prodotti dalla chemioterapia e dalla radioterapia come meccanismo d’azione principale per uccidere le cellule tumorali. Tuttavia, la maggior parte dei CIT cronici sono anche influenzati dal perpetuarsi di uno stato pro-ossidativo e dall’infiammazione.

Spesso, gli approcci più utilizzati per molti CIT includono trattamenti sintomatici, sostanze con effetto antiossidante e farmaci antinfiammatori e corticosteroidi, anche se a volte con efficacia limitata. Includiamo una breve rassegna dei meccanismi d’azione e della tossicità dei quattro farmaci (cisplatino, metotrexato, doxorubicina e bleomicina) che sono stati sottoposti a studi per valutare la modulazione CIT mediante ozono terapia.

Tossicità indotta da cisplatino

Il cisplatino, cis-diammina-dicloro-platino (CDDP) è uno dei farmaci chemioterapici più utilizzati perché è efficace contro diversi tipi di tumori. Il cisplatino è un agente alchilante non specifico della fase del ciclo cellulare. Può legarsi a proteine, RNA e DNA, inibendo la sintesi del DNA e il ciclo cellulare e può anche indurre l’apoptosi.

Le tossicità più comuni indotte dal cisplatino sono nausea, vomito, mielosoppressione, alterazioni ioniche, alopecia, sterilità e altre. Tuttavia, tra le più rilevanti e dose-limitanti sono l’ototossicità, la neuropatia periferica e soprattutto la nefrotossicità.

Oggi, si suggerisce che le tossicità associate al cisplatino siano principalmente indotte dalla produzione di radicali liberi, che provocherà danni ossidativi agli organi. L’evidenza sta crescendo sugli effetti protettivi degli antiossidanti sulle reazioni avverse indotte dal cisplatino, in particolare, la nefrotossicità [8,9,10].

La via principale per l’eliminazione del cisplatino è attraverso i reni e circa uno su tre o quattro pazienti trattati con dosi complete di cisplatino potrebbe sviluppare una disfunzione renale; la percentuale potrebbe essere superiore al 50% nei bambini. Questo danno può essere prodotto a diverse strutture renali: vasi sanguigni (con vasocostrizione una diminuzione del flusso sanguigno renale), glomeruli e principalmente, nelle cellule tubulari prossimali [9,10].

Tossicità indotta da metotrexato

Il Metotrexato (MTX) agisce come un antimetabolita, bloccando la diidrofolato reduttasi e inibendo la formazione di acido tetraidrofolico (acido folico ridotto). In questo modo, MTX inibisce la formazione di timidilato dal deossiuridilato e inibisce la sintesi del DNA.

Questa azione e l’ulteriore inibizione dell’RNA e della sintesi delle proteine ​​impedisce alle cellule di entrare nella fase S del ciclo cellulare (MTX è un agente specifico del ciclo cellulare).

MTX è utilizzato contro molti tumori diversi e in alcune malattie autoimmuni come l’artrite reumatoide. Sebbene MTX sia somministrato in modo sicuro alla maggior parte dei pazienti, può causare una tossicità significativa, specialmente con schemi cronici o ad alto dosaggio. Oltre alla mielosoppressione, le più rilevanti potrebbero essere polmonite (specialmente nelle aree irradiate), enterite, leucoencefalopatia (intratecale combinata con somministrazione sistemica ad alte dosi) e soprattutto, danno epatico e renale acuto che può verificarsi nel 2–12% dei pazienti.

La nefrotossicità deriva dalla cristallizzazione del metotrexato nel lume tubulare renale, che porta a tossicità tubulare. Il danno renale acuto e altre tossicità dell’MTX ad alte dosi possono portare a morbilità significativa, ritardi nel trattamento e ridotta funzionalità renale [11].

Gli effetti di MTX in vivo possono essere mediati riducendo la proliferazione cellulare, aumentando il tasso di apoptosi delle cellule T, aumentando il rilascio di adenosina endogena, alterando l’espressione delle molecole di adesione cellulare, influenzando la produzione di citochine, risposte umorali e formazione ossea.

Diversi rapporti indicano che gli effetti di MTX sono influenzati da varianti genetiche, processi dinamici specifici ed elementi microambientali come la privazione dei nucleotidi oi livelli di glutatione [12]. La tossicità indotta da MTX è stata correlata allo stress ossidativo [13] e alla sottoregolazione del fattore 2 correlato al fattore nucleare eritroide 2 (Nrf2) e all’eme ossigenasi-1 (HO-1) [14].

Tossicità indotta dalla doxorubicina

La doxorubicina (DOX) è un antibiotico antitumorale antraciclina utilizzato contro un gran numero di tumori. È aspecifico della fase del ciclo cellulare per intercalazione tra coppie di basi del DNA e blocca l’azione della topoisomerasi II e inibisce la sintesi del DNA e dell’RNA.

Analogamente a molti altri agenti chemioterapici, DOX produce spesso mielosoppressione, nausea, vomito e alopecia. Tuttavia, due potenziali tossicità indotte da DOX sono a livello cutaneo e cardiaco. DOX è un agente vescicante e il suo stravaso può produrre ulcerazioni e necrosi locali.

D’altra parte, una potenziale e caratteristica tossicità indotta da DOX è la cardiomiopatia con insufficienza cardiaca congestizia. Questo effetto cardiotossico è dose-limitante e dipendente dalla dose cumulativa, con un alto rischio di aumento a dosi cumulative superiori a 550 mg / m2, o anche inferiori (400 mg / m2) in pazienti con precedente irradiazione toracica, precedente cardiopatia o in combinazione con altri farmaci.

Lo stress ossidativo rimane il meccanismo più probabile per l’ effetto cardiotossico indotto da DOX , mediato dalla produzione del complesso di ferro e dalla successiva generazione di radicali liberi [15,16]. In pazienti selezionati, il dexrazoxano può essere utilizzato per prevenire / diminuire la cardiotossicità indotta da DOX, poiché il dexrazoxano è un chelante del ferro che riduce il legame con il ferro DOX e la successiva generazione di radicali liberi.

Tossicità indotta dalla bleomicina

La bleomicina (BLM) è un farmaco redox attivo con antitumorale e altre applicazioni cliniche. Il BLM è un agente efficace contro i linfomi, i tumori delle cellule germinali dei testicoli e delle ovaie e alcuni carcinomi squamosi. Si ritiene che l’effetto antineoplastico del BLM comporti la produzione di rotture a singolo e doppio filamento nel DNA (scissione) da parte di un complesso di BLM, ioni ferrosi e ossigeno molecolare.

La bleomicina si lega al DNA per intercalazione della frazione ditiazolica tra coppie di basi del DNA e per interazioni elettrostatiche delle ammine terminali. La riduzione dell’ossigeno molecolare da parte di ioni ferrosi chelati da BLM porta alla sottrazione di idrogeno dai carboni C3 e C4 del desossiribosio, con conseguente scissione del legame C3-C4 e liberazione di una base con rottura del filamento di DNA.

La BLM è inattivata in vivo dall’enzima BLM idrolasi, un’aminopeptidasi citosolica che ha una minore attività nella pelle e nei polmoni. La bleomicina è selettivamente tossica per le cellule nelle fasi M e G2 del ciclo cellulare e generalmente più efficace contro la divisione attiva piuttosto che contro le cellule a riposo [17].

Nonostante sia uno degli agenti chemioterapici ad ampio spettro più efficaci nel trattamento dei tumori, le applicazioni cliniche del BLM sono state limitate a causa dell’effetto collaterale di causare la fibrosi polmonare [18]. Il rischio di fibrosi indotta da BLM è aumentato dai miglioramenti nella sopravvivenza globale e in quei pazienti con precedenti malattie polmonari o irradiazione toracica.

Il meccanismo del danno polmonare indotto da BML non è del tutto chiaro, ma probabilmente include componenti del danno ossidativo, relativa carenza dell’enzima disattivante BML idrolasi, suscettibilità genetica ed elaborazione di citochine infiammatorie.

Il danno ossidativo al polmone sembra importante nella fisiopatologia del danno polmonare e gli antiossidanti possono migliorare il processo [19]. La somministrazione sistemica di artemisitene antiossidante inibisce fortemente il danno polmonare indotto dalla bleomicina, attraverso l’attivazione della via di segnalazione Nrf2 [20].

Modulazione dello stress ossidativo mediante ozono terapia

Le applicazioni locali di ozono possono indurre effetti diretti ed effetti di modulazione a livello locale. Tuttavia, quando l’ozonoterapia è applicata con intento sistemico (principalmente per autoemoterapia e per insufflazione rettale), l’ozono non entra nella circolazione sanguigna e non è in grado di raggiungere alcun tessuto bersaglio specifico.

L’ozono che non viene rimosso dagli antiossidanti del mezzo interagisce con gli acidi grassi insaturi delle membrane cellulari della mucosa intestinale (somministrazione rettale) o dei globuli (nella miscela extracorporea sangue-ozono, durante l’autoemoterapia) generando aldeidi e idrossi- idroperossido (perossido di ozono), che forma H2O2 e una seconda aldeide – 4-idrossinonenale (4-HNE), che è una delle aldeidi più rilevanti.

Queste sostanze agiscono come secondi messaggeri e inducono un’ulteriore risposta adattativa dal corpo (con potenziale sovraregolazione dei sistemi antiossidanti) in una relazione ormetica dose-risposta [21,22,23].

Cioè, il meccanismo d’azione dell’ozono terapia sistemica è un effetto “indiretto”. L’ozono non segue i principi standard della farmacologia: assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione.

L’ozono “agisce” solo come modulatore o pro-farmaco e, inducendo messaggeri secondari, migliorerà le successive risposte adattative. Dopo questa reazione rapida (pochi secondi), l’ozono scompare. La concentrazione e gli effetti dell’ozono non seguono una relazione lineare: concentrazioni molto basse potrebbero non avere effetto e concentrazioni molto alte possono portare ad effetti contrari a quelli prodotti da concentrazioni medio / basse [24].

I mediatori come 4-HNE e H2O2 sono tra i messaggeri secondari più rilevanti indotti dall’ozono durante la tossicità polmonare a seguito di inalazione delle vie aeree [25,26] ma anche, nel corso dell’induzione di effetti benefici durante l’applicazione medica [2,27].

Inoltre, H2O2 può entrare nel citoplasma delle cellule mononucleate e modulare il fattore nucleare kappa B (NF-κB). H2O2 non emerge come un induttore di NF-κB, ma come un agente in grado di modulare l’attivazione della via NF-κB da parte di altri agenti.

Questa modulazione è generica a livello dell’intero percorso ma specifica a livello del singolo gene. Pertanto, H2O2 è un regolatore fine dei processi dipendenti da NF-KB, come esemplificato dalla sua doppia regolazione dell’infiammazione [28].

Molto probabilmente, la dose terapeutica di O3 blocca il segnale NF-κB, riducendo l’infiammazione [29]. Al contrario, una dose elevata di O3 promuove l’infiammazione mediante l’attivazione della via NF-κB [30]. Inoltre, H2O2 può agire come promotore della via Nrf2. L’importante ruolo dell’induzione di Nrf2 da parte dell’ozono al fine di potenziare i sistemi antiossidanti è stato descritto recentemente [31,32,33].

Esiste un ampio consenso sulla rilevanza dell’induzione di molecole protettive durante stress ossidativi piccoli ma ripetuti [22,34]. L’aldeide più rilevante prodotta dalla reazione dell’O3 è la 4-HNE, che rimane più stabile del ROS [22,27]. Il 4-HNE è noto per essere abbastanza reattivo; partecipa a molteplici processi fisiologici come messaggero secondario non classico e forma prontamente modificazioni covalenti di numerosi bersagli [35].

Il 4-HNE viene rapidamente degradato da alcol deidrogenasi, aldeide deidrogenasi e glutatione-S-transferasi. 4-HNE formerà addotti con il tiolo (-SH) e i gruppi amminici di Cys34 presenti nel dominio I dell’albumina.

In questo modo, 4-HNE può inviare un segnale di stress ossidativo transitorio a diversi tessuti del corpo ei suoi effetti dipendono dalla concentrazione e dall’origine della cellula / tessuto.

Questo percorso può attivare la sintesi di diverse sostanze come: γ-glutamil transferasi, γ-glutamil transpeptidasi, HSP-70, HO-1 ed enzimi antiossidanti come SOD, GSH-Px, catalasi e glucosio-6-fosfato deidrogenasi ( G6PDH, un donatore di elettroni enzimatico critico durante l’eritropoiesi nel midollo osseo) e la via Nrf2.

Inoltre, questi effetti pluripotenti del 4-HNE possono essere spiegati dalle sue interazioni dipendenti dalla concentrazione con le reti di citochine e sistemi antiossidanti cellulari complessi che mostrano anche specificità cellulari e tissutali [2,36].

Come accade con le potenziali azioni dell’ozono, le potenziali azioni del 4-HNE sono molto diverse a concentrazioni inferiori (regolazione della proliferazione e differenziazione e potenziamento di Nrf2 e dei sistemi antiossidanti) rispetto ad alte concentrazioni (induzione di stress ossidativo, apoptosi e necrosi).

I risultati sperimentali hanno dimostrato che l’ozono ex vivo o in vivo può attivare Nrf2 [7,37]. Questo meccanismo può spiegare il target genomico dell’ozono, che induce la risposta proteomica (sintesi proteica, come enzimi antiossidanti: ad esempio, HO-1, SOD, CAT), fornendo una protezione di gran lunga migliore contro gli effetti dannosi per il corpo intero dai radicali liberi.

Inoltre, un manoscritto molto recente dimostra il ruolo dell’ozono sulla caseina chinasi 2 (CK2) (un altro regolatore dell’attività Nrf2 attraverso la sua fosforilazione) in pazienti con sclerosi multipla [38]. Tuttavia, gli effetti dell’ozono coinvolgono anche la modulazione (inibizione) della via NF-κB.

Questo percorso attiva il rilascio di citochine pro-infiammatorie come: TNFα, INFγ, IL1β, IL6, IL8, nonché geni pro-infiammatori come la cicloossigenasi-2 (COX-2) e l’ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS) [39 ]. Di conseguenza, la dose somministrata nell’ozonoterapia e la sua risposta ormetica hanno un ruolo cruciale per gestire le risposte infiammatorie / proinfiammatorie di equilibrio.

Sia la regolazione Nrf2 che quella NF-κB sono coordinate per mantenere l’omeostasi redox nelle cellule sane. Tuttavia, in condizioni patologiche, questa regolazione è perturbata, offrendo un’opportunità di intervento terapeutico [39,40].

La regolazione dell’infiammazione mediante la segnalazione NF-κB e le vie Nrf2 separatamente è ampiamente documentata. Dal momento che entrambe queste principali vie di segnalazione modulano l’infiammazione, possono interagire per determinare risposte infiammatorie coordinate (Figura 1) [41,42].

Ozonoterapia nella tossicità indotta dalla chemioterapia

Poiché l’ozono può modulare lo stress ossidativo, l’infiammazione e l’ischemia / ipossia, ci si potrebbe aspettare che eserciti un effetto benefico nella CIT cronica quando questi meccanismi sono coinvolti. Diversi modelli sperimentali e studi clinici isolati hanno dimostrato i suoi benefici nella prevenzione e / o nel trattamento della CIT da parte di alcuni farmaci chemioterapici, in particolare cisplatino, metotrexato, doxorubicina e bleomicina. Infine, descriveremo alcuni studi correlati che offrono ulteriore supporto all’effetto protettivo dell’ozono contro CIT.

Tossicità indotta da ozono e cisplatino

Negli ultimi 15 anni, diversi modelli sperimentali hanno descritto gli effetti ed i potenziali meccanismi d’azione dell’ozono per la prevenzione (mediante precondizionamento dell’ozono) o per il trattamento (alterazioni stabilizzate) del danno renale da parte del cisplatino.

Nel 2004, Borrego et al. [44] hanno descritto l’effetto del precondizionamento dell’ozono (somministrazione di ozono prima della somministrazione di cisplatino) per prevenire la nefrotossicità del cisplatino. Nove millilitri di ozono sono stati somministrati, a diverse concentrazioni, per insufflazione rettale: una seduta / giorno per 15 giorni consecutivi prima del giorno dell’iniezione intraperitoneale di cisplatino. I ratti sono stati sacrificati 5 giorni dopo l’iniezione di cisplatino.

Per quanto riguarda il gruppo di controllo senza trattamento, i gruppi con solo O2 o con solo O3 (senza cisplatino) hanno mostrato livelli simili di creatinina sierica (come marker di danno renale), così come livelli renali di radicali liberi (misurando le sostanze reattive all’acido tiobarbiturico —TBARS) e antiossidanti (GSH, SOD, CAT, GSH-Px).

Il gruppo cisplatino ha mostrato un aumento della creatinina sierica (quattro volte) e TBARS (due volte) e una diminuzione di tutti gli antiossidanti (tra il 15 e il 40%). Per quanto riguarda il gruppo cisplatino, la somministrazione di cisplatino con O2 o con basse concentrazioni di O3 (10 µg / mL) non ha mostrato variazioni rilevanti e il cisplatino con alte concentrazioni di O3 (50 o 70 µg / mL) ha mostrato livelli di creatinina simili (o anche peggiori), con risultati deludenti nei livelli di antiossidanti.

Il precondizionamento di cisplatino più O3 / O2 a queste concentrazioni più elevate (50 e 70 µg / ml) ha mostrato cambiamenti istopatologici abbastanza simili a quelli presenti con il cisplatino da solo. Tuttavia, i ratti trattati con cisplatino e precondizionamento di O3 a concentrazioni moderate (20 o 30 µg / mL) hanno mostrato un aumento relativamente inferiore dei livelli di creatinina (solo due volte) e TBARS, e un livello di antiossidanti simile o addirittura superiore ai livelli di il gruppo di controllo.

I modelli di variazione dei livelli di creatinina, radicali liberi e antiossidanti erano simili a quelli descritti nella Figura 2. Nell’analisi istopatologica, il trattamento con cisplatino da solo ha mostrato un’intensa necrosi tubulare e formazione di gesso nel lume, mentre il trattamento con cisplatino O3 / O2 precondizionamento a 30 µg / mL non hanno mostrato differenze significative con i ratti non trattati.

Sempre nel 2004, questo gruppo ha studiato l’effetto della somministrazione di ozono dopo nefrotossicità acuta indotta da cisplatino [45]. In questo studio, il cisplatino è stato somministrato prima del trattamento con ozono. Successivamente, O3 / O2 è stato somministrato a diverse concentrazioni (10, 30 e 50 µg / mL) mediante insufflazione rettale: una sessione / giorno per cinque giorni consecutivi.

I ratti furono sacrificati un giorno dopo. Il cisplatino da solo o il cisplatino + ossigeno hanno mostrato livelli simili di tutti i parametri, ovvero: l’aggiunta di ossigeno non ha avuto alcun effetto. Rispetto al gruppo di controllo (senza cisplatino), il gruppo cisplatino ha mostrato aumenti significativi della creatinina (marker di danno renale) e TBARS.

Tutti i gruppi cisplatino + ozono hanno mostrato livelli di parametri più vicini a quelli del gruppo di controllo e una differenza statisticamente significativa con il solo cisplatino: minore aumento della creatinina e TBARS e minore diminuzione (o addirittura aumento) degli antiossidanti.

Inoltre, il trattamento con cisplatino da solo ha mostrato una necrosi tubulare grave e diffusa con dilatazione dei tubuli prossimali e formazione di gesso nel lume, mentre il trattamento con cisplatino e ulteriore O3 / O2 ha mostrato anche necrosi tubulare, ma in misura minore.

Pertanto, nel lavoro precedente, questo gruppo ha descritto un effetto preventivo contro il danno indotto dal cisplatino nei reni dal precondizionamento dell’ozono [44], mentre l’attuale studio ha mostrato un parziale recupero del danno già stabilito mediante il trattamento con ozono dopo la somministrazione di cisplatino [45]. I modelli di cambiamento nei livelli di creatinina, radicali liberi e antiossidanti erano simili a quelli descritti nella Figura 2.

Successivamente, nel 2006 [46], lo stesso gruppo ha valutato il pattern di espressione renale di Bax in ratti trattati con cisplatino senza / con somministrazione di O3 / O2 solo alla concentrazione ottimale di O3 / O2 di 30 µg / mL, seguendo i due approcci precedenti :

(1) con l’approccio di prevenzione del 1 ° studio, con precondizionamento dell’ozono somministrato prima dell’iniezione di cisplatino (mediante insufflazione rettale, una sessione / giorno per 15 giorni), e

(2) con l’approccio di trattamento del 2 ° studio, dopo iniezione di cisplatino, (mediante insufflazioni rettali O3 / O2, una seduta / giorno per 5 giorni).

L’espressione della proteina Bax gioca un ruolo rilevante nell’induzione dell’apoptosi. Come descritto anni prima [47], la tossicità indotta dal cisplatino era anche associata ad una maggiore espressione della proteina Bax, nel citoplasma e nel nucleo in questo lavoro [46].

Nel complesso, nell’analisi immunoistochimica, i ratti che ricevevano iniezione di cisplatino e insufflazioni di O3 / O2 a 30 µg / mL hanno mostrato una minore espressione di Bax, sia nell’approccio preventivo che in quello terapeutico, sebbene quest’ultimo (con solo cinque sessioni O3 / O2) abbia mostrato una minore diminuzione dell’espressione di Bax, che era più rilevante nella zona della corteccia. Come negli studi precedenti, rispetto al gruppo di controllo, l’aumento dei livelli di creatinina era significativamente inferiore nei ratti trattati con cisplatino e ozono,

È stato descritto che alti livelli di ROS possono diminuire l’espressione di Bcl-2 e aumentare l’espressione di Bax, con una riduzione finale del rapporto Bcl-2 / Bax con effetto proapoptotico, come avviene con il danno indotto da cisplatino, mentre basse dosi di ROS possono attivare vie di segnalazione della sopravvivenza cellulare come Nrf2 e il suo HO-1 a valle, che possono potenzialmente ridurre la citotossicità [48].

In questo modo, l’espressione di HO-1 è stata efficacemente descritta come un modulatore della tossicità renale indotta dal cisplatino e il suo aumento come un potenziale approccio per ridurre il danno renale [49,50]. Come descritto in questi lavori, l’insufflazione rettale di O3 / O2 a concentrazioni appropriate potenzia i meccanismi antiossidanti nel tessuto renale, il che può spiegare il suo effetto nel prevenire o diminuire il danno renale indotto dal cisplatino.

Ulteriore supporto è stato fornito anni dopo, quando è stato descritto che la concentrazione appropriata di O3 / O2 (questo è uno stimolo ROS moderato) induce Nrf2 come meccanismo per aumentare HO-1 [27] e meccanismi antiossidanti che portano a diminuire lo stress ossidativo e pro -citochine infiammatorie [7,37,38,51].

Infine, nel 2016, Kocak et al. [52] ha pubblicato un diverso lavoro sperimentale, valutando l’effetto di O3 / O2 nella gestione dell’ototossicità indotta da cisplatino già accertata. I ratti sono stati trattati con ozono intratimpanico e rettale una sessione / giorni per 7 giorni.

Tutti i ratti hanno ricevuto cisplatino intraperitoneale (per 3 giorni) per produrre ototossicità. Dopo 1 settimana, l’ototossicità è stata confermata testando le emissioni otoacustiche del prodotto di distorsione. Quindi, i ratti sono stati randomizzati a quanto segue: (1) nessun trattamento (gruppo di controllo), (2) ozono per insufflazione rettale o (3) “ozono per insufflazione rettale + somministrazione intratimpanica di ozono”.

L’insufflazione rettale e intratimpanica era 2,3–3 mL di gas O3 / O2 a una concentrazione di 60 µg / mL. Il trattamento con ozono è stato 1 / giorno per 7 giorni. I ratti sono stati sacrificati dopo il 7 ° giorno. Rispetto al gruppo di controllo, i ratti di entrambi i gruppi dell’ozono hanno mostrato una significatività statistica (p <0,05): (1) risultati migliori nei test delle emissioni otoacustiche del prodotto di distorsione (questo è: recupero parziale dell’udito) e (2) danno alle cellule ciliate nell’analisi del punteggio dell’esame istopatologico dell’orecchio interno.

Non sono state osservate differenze tra i gruppi di ozono. Pertanto, si è concluso che l’insufflazione rettale di ozono era efficace nel trattamento del danno cellulare nell’ototossicità indotta da cisplatino e che la somministrazione intratimpanica di ozono non aveva alcun vantaggio aggiuntivo rispetto alla somministrazione rettale. Questo studio non ha valutato i parametri dello stress ossidativo.

Complessivamente, i modelli sperimentali sopra descritti mostrano che il trattamento con cisplatino era associato a una diminuzione degli antiossidanti, aumento dei radicali liberi e funzionali (creatinina) e danno istopatologico a carico dei reni e delle orecchie. Tuttavia, l’aggiunta di ozono al trattamento è stata in grado di diminuire tutte queste alterazioni. Questi risultati suggeriscono un potenziale beneficio clinico nel trattamento e nella prevenzione dell’ototossicità e della nefrotossicità indotte da cisplatino, che sono dose-limitanti.

Ozono nella tossicità indotta da metotrexato

Nel 2009, Kesik et al. [53] hanno descritto l’effetto del precondizionamento dell’ozono per prevenire il danno addominale mediante MTX, con valutazione nel fegato, nei reni e nei tessuti intestinali. La somministrazione di ozono (dose totale di 0,72 mg / kg) era per via intraperitoneale: una sessione / giorno per 15 giorni consecutivi prima del giorno dell’iniezione intraperitoneale di MTX.

I ratti sono stati sacrificati 5 giorni dopo l’iniezione di MTX. Sono stati valutati in tre gruppi: sham, MTX e MTX + ozono. Le differenze nei radicali liberi e negli antiossidanti tra i gruppi di studio erano statisticamente significative e simili in tutti i tessuti: 1) Rispetto a sham, il gruppo MTX ha mostrato un aumento di MDA e una diminuzione di SOD e GSH-Px rispetto al solo MTX; MTX + ozono ha mostrato MDA diminuito e SOD e GSH-Px aumentati.

I modelli di cambiamento erano simili a quelli descritti nella Figura 2. Tuttavia, in questo studio, i punteggi istopatologici per la valutazione del danno tissutale erano statisticamente significativi solo nell’ileo, che mostrava un punteggio di danno inferiore nel gruppo MTX + ozono rispetto al solo MTX, ovvero: a livello istopatologico, l’aggiunta di ozono ha migliorato il danno intestinale 5 giorni dopo la somministrazione di MTX [53].

Nel 2015, Aslaner et al. ha pubblicato due articoli con una metodologia simile per valutare l’effetto del “precondizionamento con ozono + trattamento con ozono” nella nefrotossicità indotta da MTX [54] e nell’epatotossicità [55]. La durata degli studi è stata di 21 giorni. Tutti i gruppi hanno ricevuto 5 mL di somministrazione intraperitoneale di soluzione salina fisiologica (gruppi di controllo e MTX) o O3 / O2 (gruppi MTX + ozono).

I gruppi MTX e MTX + ozono hanno ricevuto una singola somministrazione intraperitoneale di MTX al 16 ° giorno. Inoltre, i gruppi MTX + ozono hanno ricevuto O3 / O2 (a 25 µg / mL) per via intraperitoneale, una sessione / giorno per 15 giorni consecutivi prima dell’iniezione di MTX e cinque giorni aggiuntivi dopo l’iniezione di MTX.

I ratti sono stati sacrificati il ​​21 ° giorno dello studio. Rispetto ai gruppi di controllo, i gruppi MTX hanno mostrato un aumento significativo dei livelli sierici di ALT, ST, TNF-α e IL-1β e livelli tissutali di MDA e mieloperossidasi (MPO), nonché una significativa diminuzione dei livelli tissutali di GSH.

Tuttavia, rispetto al solo MTX, i gruppi MTX + ozono hanno mostrato livelli sierici di ALT, ST, TNF-α e IL-1β significativamente più bassi e livelli tissutali di MDA e MPO, nonché livelli tissutali significativamente più alti di GSH [54,55 ]. Rispetto ai gruppi MTX, i gruppi MTX + ozono hanno mostrato un punteggio di danno istopatologico inferiore, con differenze statisticamente significative nel tessuto renale. I modelli di cambiamento nei livelli di MDA e GSH erano simili a quelli descritti nella Figura 2.

Nel 2016, Leon Fernandez et al. [56], hanno descritto i risultati di uno studio randomizzato controllato (RCT) che utilizzava MTX senza / con concomitante ozono terapia in pazienti con artrite reumatoide. Sessanta pazienti sono stati randomizzati in due gruppi a:

(1) trattamento standard (gruppo MTX), con MTX (12,5 mg intramuscolare) 1 / settimana + ibuprofene + acido folico; oppure

(2) trattamento standard + ozono (MTX + gruppo ozono), con 20 insufflazioni rettali, 1 / giorno, 5 giorni / settimana per 4 settimane.

La concentrazione e il volume di O3 / O2 sono stati progressivamente aumentati, al fine di migliorare la risposta adattativa: da 25 µg / mL per 100 mL la 1a settimana a 40 µg / mL per 200 mL la 4a settimana. I pazienti nel gruppo MTX hanno ricevuto solo un trattamento standard. I pazienti nel gruppo MTZ + ozono hanno ricevuto lo stesso trattamento standard + ozono con 20 insufflazione rettale, 1 / giorno, 5 giorni / settimana per 4 settimane. La concentrazione e il volume di O3 / O2 sono stati progressivamente aumentati, al fine di migliorare la risposta adattativa: da 25 µg / mL per 100 mL la 1a settimana a 40 µg / mL per 200 mL la 4a settimana.

I parametri clinici e i marcatori biochimici dello stress ossidativo sono stati valutati prima e dopo il trattamento. Il gruppo MTX non ha mostrato differenze nel punteggio di attività della malattia o nell’indice di disabilità del questionario di valutazione della salute, mentre il gruppo MTX + ozono ha mostrato un miglioramento significativo e clinicamente rilevante in entrambi i parametri, nonché una diminuzione più notevole dell’intensità del dolore, secondo il scala analogica (VAS).

Rispetto ai pazienti trattati nel gruppo MTX, alla fine dello studio, i pazienti trattati con concomitante ozono terapia hanno mostrato livelli significativamente più alti di antiossidanti (SOD, CAT, GSH) e livelli più bassi di marker di stress ossidativo come i prodotti proteici di ossidazione avanzata (AOPP ), ossido nitrico (NO), idroperossidi totali (TH) e malondialdeide (Figura 3).

Nel complesso, i lavori sopra descritti mostrano che il trattamento con MTX era associato a una diminuzione degli antiossidanti, aumento dei radicali liberi e danno istopatologico nel fegato del rene e nei tessuti intestinali. Tuttavia, l’aggiunta di ozono al trattamento è stata in grado di diminuire queste alterazioni. Questi risultati sono di buon auspicio per un potenziale beneficio clinico dell’ozono nel trattamento e nella prevenzione della tossicità indotta da MTX in questi problemi, e sono ulteriormente supportati dai risultati nell’unico studio clinico pubblicato fino ad oggi [57].

Ozono nella tossicità indotta dalla doxorubicina

Nel 2004, Calunga et al. [58] hanno descritto un modello sperimentale di glomerulonefrite con una singola somministrazione di DOX. Dopo 10 settimane, i ratti sono stati trattati con insufflazione rettale O3 / O2: una seduta / giorno per 15 giorni, a diverse concentrazioni. In questo studio, concentrazioni inferiori di O3 / O2 (15 µg / mL) hanno mostrato risultati migliori rispetto a concentrazioni moderate (20 e 30 µg / mL) contro le alterazioni indotte da DOX sulla pressione arteriosa sistolica, diuresi e proteinuria. Tuttavia, questo studio non ha valutato l’effetto sullo stress ossidativo o sugli antiossidanti.

Nel 2014 Delgado-Roche et al. [57] hanno descritto che il precondizionamento dell’ozono potrebbe prevenire la cardiotossicità indotta da DOX. I ratti sono stati assegnati a quattro gruppi: (1) controllo (senza DOX), (2) DOX da solo, (3) DOX + ossigeno e (4) DOX + ozono. Il DOX intraperitoneale è stato somministrato due volte a settimana per 50 giorni. La somministrazione di O3 / O2 è avvenuta mediante insufflazione rettale, a un volume di 6 mL e concentrazioni di 50 µg / mL nel gruppo DOX + ozono e 0 µg / mL (solo ossigeno) nel gruppo DOX + ossigeno. In entrambi i gruppi O3 / O2, sono state somministrate 20 sessioni, 1 / giorno, prima dell’inizio dell’iniezione di DOX.

I ratti sono stati sacrificati dopo 50 giorni. Non c’erano differenze significative tra il gruppo DOX e il gruppo DOX + ossigeno.

Rispetto al gruppo di controllo, entrambi hanno mostrato: (1) una diminuzione degli antiossidanti (CAT e SOD) e (2) un aumento dei radicali liberi (MDA, AOPP) e del peptide natriuretico pro-cervello (pro-BNP) come marker di danno cardiaco. Tuttavia, il gruppo DOX + ozono ha mostrato livelli di pro-BNP, radicali liberi e antiossidanti significativamente più vicini a quelli del gruppo di controllo.

I modelli di cambiamento dei livelli di pro-BNP, radicali liberi e antiossidanti erano simili a quelli descritti nella Figura 2. Inoltre, l’analisi istopatologica del gruppo DOX ha mostrato danni significativi nel tessuto cardiaco (perdita subendocardica di fibre muscolari, lieve edema e necrosi) , mentre il gruppo DOX + ozono ha mostrato solo danni minori [57].

Nel 2016, Kesik et al. [59], hanno descritto l’effetto dell’applicazione topica di ozono (olio d’oliva ozonizzato) nella gestione della necrosi cutanea indotta da DOX.

Questo studio ha valutato diversi trattamenti topici in un modello sperimentale di necrosi cutanea indotta dall’iniezione intradermica di doxorubicina. I gruppi più rilevanti in questo studio erano: (1) gruppo di controllo (DOX senza ulteriore trattamento), (2) DOX + dimetilsolfossido (DMSO) e (3) DOX + olio d’oliva ozonizzato. Si prevedeva che la necrosi cutanea massima si fosse verificata il giorno 14 dopo l’iniezione, quindi è stato questo il momento in cui è stata effettuata l’analisi.

Le biopsie dalle aree necrotiche a 14 giorni non hanno mostrato differenze significative nei livelli tissutali di MDA, IL1β, SOD o GSH-Px. Tuttavia, rispetto al gruppo di controllo, il TNFα era significativamente inferiore nei gruppi DMS e olio d’oliva ozonizzato, senza differenze statisticamente significative osservate tra gli ultimi due gruppi.

Il gruppo dell’olio d’oliva ozonizzato è stato l’unico che ha mostrato una diminuzione statisticamente significativa delle dimensioni dell’ulcera e della percentuale di variazione (diminuzione) del punteggio istopatologico dell’ulcera. Il DMSO è un agente antiossidante solitamente utilizzato nella gestione delle lesioni da stravaso indotte da DOX.

In questo studio, gli autori hanno dimostrato che l’uso topico di olio d’oliva ozonizzato ha migliorato questo danno almeno quanto il DMSO [59]. La Figura 4 mostra un’esperienza clinica correlata nella nostra istituzione durante la gestione di un paziente con necrosi cutanea secondaria a stravaso di Doxorubicina.

Nel 2017 Salem et al. [60] hanno valutato gli effetti citoprotettivi dell’ozono (e della rutina e la loro combinazione) sulla tossicità testicolare indotta da DOX. La DOX intraperitoneale è stata somministrata 3 volte a settimana per 2 settimane dall’inizio del punto temporale. A partire dallo stesso punto temporale di inizio, tutti i gruppi hanno ricevuto un’insufflazione di gas rettale (5 mL): una sessione / giorno, 5 giorni / settimana per 3 settimane.

I gruppi placebo e doxorubicina hanno ricevuto insufflazioni solo con O2. Nel gruppo ozono, l’insufflazione di gas era a concentrazioni di O3 / O2 di 25 µg / mL la 1a settimana e 50 µg / mL la 2a e 3a settimana. Lo studio è stato interrotto 21 giorni dopo l’inizio del trattamento.

Rispetto al placebo, il gruppo DOX ha mostrato una significativa diminuzione della conta, della motilità e della vitalità degli spermatozoi e un aumento significativo della morfologia anormale. Tutte queste alterazioni erano significativamente inferiori nel gruppo con DOX + ozono. Nel siero, DOX ha mostrato una diminuzione significativa dei livelli di testosterone e aumenti significativi dell’ormone luteinizzante (LH) e dell’ormone follicolo-stimolante (FSH), mentre nel gruppo DOX + ozono queste alterazioni erano significativamente inferiori.

Nel tessuto testicolare, il gruppo DOX ha mostrato un aumento significativo e rilevante di g-glutamiltransferasi (GGT), fosfatasi alcalina (ALP), fosfatasi acida, proteina C-reattiva (CRP), proteina chemiotattica dei monociti cerebrali-1 (MCP-1), malondialdeide (MDA) e ossido nitrico (NO), mentre tutti questi valori nel gruppo DOX + ozono erano significativamente inferiori e più vicini a quelli del gruppo placebo.

D’altra parte, la capacità antiossidante totale (TAC) era significativamente diminuita nel gruppo DOX, mentre nel gruppo DOX + ozono, c’era una diminuzione inferiore ei livelli erano più vicini al gruppo placebo. I modelli di cambiamento nell’MDA e nella capacità antiossidante erano simili a quelli descritti nella Figura 2.

Infine, il recente lavoro di Kamble et al. nel 2018 merita una menzione. Utilizzando una terapia diversa (acido asiatico al posto dell’ozono), hanno descritto che l’attivazione di Nrf2 (poiché è anche indotta da O3 / O2 [7,27,37,38,51]) e l’ulteriore potenziamento dei sistemi antiossidanti possono migliorare Tossicità indotta da DOX nel cuore, nel fegato e nei reni [61].

Nel complesso, i modelli sperimentali sopra descritti mostrano che il trattamento con DOX era associato a una diminuzione degli antiossidanti, aumento dei radicali liberi e del danno funzionale e istopatologico a carico di reni, cuore, pelle e testicoli. Tuttavia, l’aggiunta di ozono al trattamento è stata in grado di migliorare queste alterazioni.

Questi risultati suggeriscono un potenziale beneficio clinico nel trattamento e nella prevenzione della tossicità indotta da DOX e sono particolarmente rilevanti nella tossicità cardiaca indotta da DOX, che è dose-limitante.

Ozono nella tossicità indotta dalla bleomicina

Nel 2015, Santana-Rodríguez et al. [62], hanno mostrato risultati preliminari da un modello sperimentale di fibrosi polmonare indotta da bleomicina. Ventuno ratti Sprague-Dawley sono stati randomizzati in quattro gruppi: (1) controllo, senza intervento; (2) sham, con somministrazione intratracheale di 500 μL di soluzione salina; (3) BLM, con somministrazione intratracheale di BLM; (4) BLM + ozono, trattato come gruppo BLM + insufflazione rettale O3 / O2 (20 mL / kg) prima e dopo la somministrazione di BLM.

La somministrazione di O3 / O2 pre-BLM è stata di 1 / die per 15 giorni a concentrazioni crescenti da 20 μg / mL a 50 μg / mL. Dopo la somministrazione di BLM, O3 / O2 è stato somministrato a 50 μg / mL 3 volte / settimana fino al sacrificio. I ratti sono stati sacrificati 28 giorni dopo la somministrazione intratracheale di soluzione salina da sola o con BLM.

La fibrosi polmonare è stata valutata dalla scala Ashcroft in un’analisi istopatologica in cieco. I ratti trattati con BLM (con e senza ozono) hanno mostrato un aumento significativo e marcato del punteggio di fibrosi polmonare. Tuttavia, il punteggio di fibrosi era significativamente inferiore nel gruppo BLM + ozono rispetto al gruppo BLM da solo. Sfortunatamente, i livelli di radicali liberi e antiossidanti non sono stati valutati in questo studio [62].

Altri studi correlati

Sono disponibili pochi lavori clinici sugli effetti clinici dell’ozono nella gestione della CIT. Non hanno descritto la chemioterapia somministrata (o era in uno schema multi-farmaco) né hanno valutato i parametri dello stress ossidativo. Tuttavia, riteniamo che questi siano i più rilevanti.

Nel 2008, uno studio randomizzato su bambini con mucosite indotta da chemio ha dimostrato che il girasole ozonizzato topico (Oleozon®, Centro Nacional de Investigaciones Científicas, La Habana, Cuba) porta a un recupero della mucosite più elevato e più rapido rispetto al trattamento convenzionale con “Clorexidina + Nistatina” [ 63].

Borrelli, nel 2012 [64], ha mostrato risultati da un RCT di 40 pazienti con carcinoma polmonare avanzato non di piccole dimensioni trattati con chemioterapia standard (gruppo di controllo) o chemioterapia standard e ozono (e iniezione di viscum album). Una concentrazione di O3 / O2 di 30 µg / mL è stata somministrata mediante autoemoterapia una volta alla settimana per 12 settimane.

Rispetto al gruppo di controllo, i pazienti nel “gruppo chemioterapia e ozono” hanno mostrato un miglioramento significativo nel questionario sulla qualità della vita QLQ-C30), valori plasmatici potenziali antiossidanti biologici inferiori e più bassi rispetto ai valori basali.

Infine, un argomento correlato da menzionare potrebbe essere la neuropatia periferica indotta dalla chemioterapia (CIPN), che può verificarsi in più della metà dei pazienti trattati con composti platinici, taxani, vincristina o bortezomib [65] e può portare a una riduzione della dose. o addirittura interruzione della chemioterapia. Ancora una volta, tra i meccanismi associati al CIPN, sono stati descritti:

(1) apoptosi indotta da ROS e stress ossidativo,

(2) diminuzione degli antiossidanti come la vitamina E .; e (3) aumento delle citochine proinfiammatorie (IL-1, IL-6, IL-8, TNFa) [65,66,67].

Sono stati valutati diversi trattamenti, inclusi diversi approcci con antiossidanti: acetilcisteina, amifostina, glutatione, acido retinoico o vitamina E. Tuttavia, fino ad ora, gli approcci preventivi o terapeutici sono limitati in numero ed efficacia [68,69].

In queste condizioni cliniche, quando esistono opzioni terapeutiche non provate o limitate, alcuni esperti ritengono ragionevole utilizzare un trattamento basato sui suoi meccanismi di azione o sui suoi effetti nelle sindromi correlate [69].

In questo modo, sulla base del suo meccanismo d’azione e della nostra esperienza clinica con l’ozono nel dolore neuropatico secondario ai trattamenti contro il cancro (Comunicazione personale [70]), è in corso un RCT in doppio cieco con ozono terapia nella neuropatia periferica refrattaria indotta dalla chemioterapia, che comprenderà un’ampia valutazione dello stress ossidativo e dei parametri proinfiammatori (EudraCT: 2019-000821-37).

Discussione e prospettive

Complessivamente, nei modelli sperimentali sopra descritti, la somministrazione di cisplatino, doxorubicina o metotrexato è stata associata ad un aumento dei livelli sierici di marker di danno tissutale (creatinina nel danno renale, pro-BNP nel danno cardiaco) e aumento dei livelli tissutali di radicali liberi (lipidi marker di perossidazione — TBARS, MDA).

Allo stesso tempo, questi farmaci hanno ridotto i livelli tissutali di antiossidanti (GSH, SOD, catalasi, GSH-Px). Quando valutata, l’aggiunta di O2 (O3 / O2 = 0 µg / mL) a ratti trattati con questi farmaci chemioterapici non ha mostrato cambiamenti rilevanti rispetto alla sola chemioterapia, ovvero: l’aggiunta di O2 sistemico non ha indotto una diminuzione radicali e non ha aumentato i livelli di antiossidanti.

Tuttavia, quando la somministrazione di cisplatino, doxorubicina o metotrexato nei ratti era associata al precondizionamento di O3 o al trattamento di O3 a concentrazioni appropriate, i parametri di stress ossidativo erano più vicini a quelli del gruppo di controllo, ovvero:

(1) minore aumento dei livelli sierici dei marker di danno tissutale (creatinina nel danno renale, pro-BNP nel danno cardiaco),

(2) minore aumento dei livelli tissutali dei radicali liberi (marker della perossidazione lipidica – TBARS, MDA) e minore diminuzione dei livelli tissutali di antiossidanti ( GSH, SOD, catalase, GSH-Px), 3) hanno diminuito il danno nell’analisi istopatologica.

Considerando questi effetti, sappiamo che il precondizionamento ossidativo può indurre un effetto descritto anche per altri fenomeni come l’esercizio o il precondizionamento ischemico, termico e chimico. Una caratteristica comune a tutti questi processi è che uno stress ripetuto e “moderatamente controllato” è in grado di proteggere da uno stress prolungato e grave [44].

I risultati descritti con l’ozono nei modelli sperimentali descritti in questa revisione sono di buon auspicio per un potenziale beneficio clinico e sono ulteriormente supportati da una maggiore sopravvivenza nel modello sperimentale di doxorubicina più ozono [57] o dai risultati nella sperimentazione clinica di pazienti con artrite trattata con metotrexato con / senza ozono terapia [56].

Come per la chemioterapia, anche la tossicità cronica indotta dalle radiazioni è mediata da una perpetuazione locale del processo ischemico, dallo stato proinfiammatorio e proossidativo. Alcuni modelli sperimentali hanno descritto il ruolo potenziale dell’ozonoterapia nel proteggere / diminuire la tossicità a livello polmonare [71], fegato o intestinale [72].

Sfortunatamente, ancora una volta, ci sono pochi studi clinici correlati, i più notevoli sono quelli riguardanti l’uso dell’ozono terapia durante la radioterapia del cancro alla prostata per diminuire la tossicità locale [73] o dopo la radioterapia per trattare la tossicità pelvica indotta dalle radiazioni [70,74 , 75].

È necessario sottolineare che, come è usuale in medicina, concentrazioni più elevate non sono sempre migliori, come dimostrato da Borrego et al. [44], dimostrando che il precondizionamento di cisplatino più O3 / O2 a concentrazioni più elevate (50 e 70 µg / mL) ha mostrato cambiamenti istopatologici che erano abbastanza simili a quelli presenti con il solo cisplatino e risultati deludenti nei parametri biochimici.

Inoltre, i risultati erano peggiori di quelli ottenuti con concentrazioni moderate (20 o 30 µg / mL) nelle insufflazioni rettali. Vale a dire, concentrazioni molto elevate di O3 / O2 possono indurre livelli di radicali liberi troppo alti e superare la capacità di adattamento, portando a risultati peggiori o addirittura a effetti deleteri.

Allo stesso modo, gli effetti di 4-HNE, Nrf2 e NF-κB indotti dall’ozono dipendono dalla sua concentrazione e dal tipo di cellula o tessuto. Questi tre percorsi interagiscono nei processi redox e possono mostrare duplici azioni. Se provocano un aumento dello stress ossidativo, possono indurre l’inizio, la promozione o la progressione delle cellule tumorali, nonché la tossicità indotta dal trattamento; sebbene un aumento dello stress ossidativo sia il fondamento della chemioterapia e della radioterapia.

D’altra parte, un aumento degli antiossidanti potrebbe essere correlato a un minor rischio di insorgenza di tumori e tossicità indotta dal trattamento; tuttavia, potrebbe potenzialmente proteggere le cellule tumorali dai trattamenti contro il cancro. Pertanto, i loro effetti nella patologia del cancro e la loro potenziale modulazione nel trattamento del cancro sono complessi e non completamente noti [2,76,77].

A dosi fisiologiche (molto basse), 4-HNE stimola l’attività della via Nrf2 così come la proliferazione, la differenziazione e l’apoptosi. Tuttavia, basse concentrazioni potrebbero proteggere le cellule tumorali da ulteriori danni [2,77]. Al contrario, sono stati descritti studi in cui il 4-HNE è correlato alla neoplasia tumorale negli astrocitomi e nei carcinomi della mammella o del fegato [2]; sebbene, alti livelli di 4-HNE in condizioni di stress ossidativo sono stati descritti per predisporre le cellule tumorali all’apoptosi e migliorare i risultati della radioterapia nei carcinomi polmonari [77,78].

Anche il ruolo di NF-κB e Nrf2 e la loro modulazione nella patologia del cancro non è chiaro. In coincidenza con la clonazione molecolare di NF-κB / RelA e l’identificazione della sua parentela con l’oncogene v-Rel, è stato anticipato che NF-κB stesso sarebbe stato coinvolto nello sviluppo del cancro.

Le mutazioni attivanti oncogeniche nei geni NF-κB sono rare e sono state identificate solo in alcune neoplasie linfoidi, mentre la maggior parte delle mutazioni attivanti NF-κB nelle neoplasie linfoidi si verificano nei componenti di segnalazione a monte che alimentano NF-κB. L’attivazione di NF-κB è anche prevalente nei carcinomi, in cui l’attivazione di NF-κB è guidata principalmente dalle citochine infiammatorie all’interno del microambiente tumorale.

È importante sottolineare, tuttavia, che in tutte le neoplasie NF-κB agisce in modo specifico per tipo di cellula: attivando all’interno delle cellule tumorali i geni coinvolti nella sopravvivenza, proliferazione, angiogenesi, espansione e metastasi, nonché il potenziamento dei geni promotori dell’infiammazione in il microambiente tumorale.

Tuttavia, le complesse funzioni biologiche di NF-κB hanno reso il targeting terapeutico una sfida [79,80]. Inoltre, Nrf2 ha anche mostrato una duplice azione che può aumentare la resistenza al trattamento del cancro e inibire l’inizio e lo sviluppo del cancro [76].

L’aumento di Nrf2 è stato associato alla trasformazione maligna e alla progressione nel carcinoma del colon-retto [81], ha limitato il successo della temozolomide ed è implicito che svolga un ruolo nel meccanismo di resistenza ai farmaci [82] nel cancro gastrico. L’espressione di Nrf2 è positivamente correlata al cancro gastrico invasivo, suggerendo la sua utilità come indice predittivo di prognosi sfavorevole [83].

Tuttavia, l’attivazione controllata e oscillante di Nrf2 è stata anche correlata alla prevenzione dell’insorgenza e dello sviluppo del cancro [76,84]. In conclusione, sembra che la modifica dell’equilibrio di Nrf2 o NF-κB sia coinvolta nella regolazione dell’inizio / progressione del cancro e nel meccanismo di resistenza ai farmaci. Di conseguenza, gli approcci che ristabiliscono l’equilibrio Nrf2 / NF-κB dovrebbero fornire un potenziale beneficio in oncologia.

Come commentato per 4-HNE, NF-κB e Nrf2, anche l’uso di “antiossidanti ad alto dosaggio” durante la chemioterapia per prevenire la tossicità è controverso, a causa del potenziale effetto protettivo sulle cellule tumorali e del danno prognostico [85,86]. Tuttavia, l’ozono non porta ad un elevato aumento di una sostanza isolata o antiossidante. A concentrazioni appropriate, l’ozono indurrà una risposta adattativa con un “potenziamento globale” dei “meccanismi antiossidanti endogeni”, che di solito sono diminuiti nella maggior parte delle cellule tumorali.

Esiste un supporto razionale per un potenziale effetto di potenziamento della combinazione “chemioterapia + ozono” come abbiamo descritto in una recente revisione, che merita ulteriori ricerche [87]. Tuttavia, questa combinazione potenziale e controversa durante il trattamento del cancro non dovrebbe essere estremamente rilevante per i pazienti nelle seguenti situazioni:

(1) CIT attuale o potenziale porta a controindicazioni o chemioterapia di riduzione della dose. In alcune condizioni cliniche, l’aggiunta di ozono durante la chemioterapia al fine di prevenire / diminuire la CIT potrebbe aprire due ulteriori finestre di trattamento interessanti da esplorare: (a) per evitare / diminuire la riduzione della dose di chemioterapia quando è presente un qualche tipo di CIT, e ( b) la potenziale possibilità di esplorare la somministrazione della chemioterapia nelle attuali controindicazioni cliniche (ad esempio, insufficienza renale).

(2) Le cellule tumorali non sono presenti, ad esempio, nel trattamento della CIT dopo il trattamento del cancro. Sulla base della dimostrata modulazione dello stress ossidativo da parte dell’ozono, l’uso complementare dell’ozono come trattamento palliativo o compassionevole per CIT potrebbe essere supportato quando un trattamento efficace o dimostrato non esiste o non funziona, come suggerito dagli esperti [69].

In questo modo, è in corso un RCT sulla neuropatia periferica refrattaria indotta dalla chemioterapia (EudraCT: 2019-000821-37), con analisi pianificata dei marker di stress infiammatorio e ossidativo.

(3) La chemioterapia è utilizzata nella gestione della malattia senza cancro. Ciò è supportato dall’RCT sull’artrite reumatoide, dove l’aggiunta dell’ozonoterapia al trattamento con MTX ha migliorato i risultati biochimici e clinici [56].

Non c’è dubbio che tutte le questioni sopra menzionate meritino ulteriori ricerche e RCT.

Riferimenti

• 1a. Pro-MED. PRO/AH/EDR. Undiagnosed pneumonia-China (HU): request for information. Archive Number: 20191230.6864153. 30 Dec 2019. Available at: https://promedmail.org/promed-post/?id=6864153.
• 2a. Perrella A, Carannante N, Berretta M, Rinaldi M, Maturo N, Rinaldi L. Novel Coronavirus 2019 (Sars-CoV2): a global emergency that needs new approaches? Eur Rev Med Pharmacol Sci 2020; 24: 2162-2164.
• 3a. Jiang HJ, Chen N, Shen ZQ, Yin J, Qiu ZG, Miao J, Yang ZW, Shi DY, Wang HR, Wang XW, Li JW, Yang D, Jin M. Inactivation of poliovirus by ozone and the impact of ozone on the viral genome Biomed Environ Sci 2019; 32: 324-333.
• 4.a Silva RA, Garotti JE, Silva RS, Navarini A, Pacheco AM Jr. Analysis of the bactericidal effect of ozone pneumoperitoneum. Acta Cir Bras 2009; 24: 124-127.
• 5a. Rowen R. Ozone therapy as a primary and sole treatment for acute bacteria infection: case report. Med Gas Res 2018; 8: 121-124.
• 6a. Rowen R. Ozone therapy in conjunction with oral antibiotics as a successful primary and sole treatment for chronic septic prosthetic joint: review and case report. Med Gas Res 2018; 3: 8: 67-71.
• 7a. Briè A, Boudaud N, Mssihid A, Loutreul J, Bertrand I, Gantzer C. Inactivation of murine norovirus and hepatitis A virus on fresh raspberries by gaseous ozone treatment. Food Microbiol 2018; 70: 1-6.
• 8a. Murray BK, Ohmine S, Tomer DP, Jensen KJ, Johnson FB, Kirsi JJ, Robison RA, O’Neill KL. Virion disruption by ozone-mediated reactive oxygen species. J Virol Methods 2008; 153: 74-77.
• 9a. Molinari F, Simonetti V, Franzini M, Pandolfi S, Vaiano F, Valdenassi L , Liboni W. Ozone autohemotherapy induces long-term cerebral metabolic changes in multiple sclerosis patients. Int J Immunopathol Pharmacol 2014; 27: 379-389.
• 10a. Berretta M, Della Pepa C, Tralongo P, Fulvi A, Martellotta F, Lleshi A, Nasti G, Fisichella R, Romano C, De Divitiis C, Taibi R, Fiorica F, Di Francia R, Di Mari A, Del Pup L, Crispo A, De Paoli P, Santorelli A, Quagliariello V, Iaffaioli RV, Tirelli U, Facchini G. Use of complementary and alternative medicine (CAM) in cancer patients: an Italian multicenter survey. Oncotarget 2017; 8: 24401-24414.
• 11a. Tirelli U, Cirrito C, Pavanello M, Piasentin C, Lleshi A, Taibi R. Ozone therapy in 65 patients with fibromyalgia: an effective therapy. Eur Rev Med Pharmacol Sci 2019; 23: 1786-1788.

• 1. Zuo L., Prather E.R., Stetskiv M., Garrison D.E., Meade J.R., Peace T.I., Zhou T. Inflammaging and Oxidative Stress in Human Diseases: From Molecular Mechanisms to Novel Treatments. Int. J. Mol. Sci. 2019;20:4472. doi: 10.3390/ijms20184472. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 2. Milkovic L., Cipak Gasparovic A., Zarkovic N. Overview on major lipid peroxidation bioactive factor 4-hydroxynonenal as pluripotent growth-regulating factor. Free Radic. Res. 2015;49:850–860. doi: 10.3109/10715762.2014.999056. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 3. Bocci V. Ozone A New Medical Drug. 2nd ed. Springer Publishing; Dordrecht, The Netherlands: 2011. [Google Scholar]
• 4. Schwartz-Tapia A., Martínez-Sánchez G., Sabah F. Madrid Declaration on Ozone Therapy. ISCO3 (International Scientific Committee of Ozone Therapy); Madrid, Spain: 2015. [Google Scholar]
• 5. Andrady A., Aucamp P.J., Bais A., Ballare C.L., Bjorn L.O., Bornman J.F., Caldwell M., Cullen A.P., Erickson D.J., de Gruijl F.R., et al. Environmental effects of ozone depletion and its interactions with climate change: Progress report, 2008. Photochem. Photobiol. Sci. 2009;8:13–22. [PubMed] [Google Scholar]
• 6. Bocci V. Is it true that ozone is always toxic? The end of a dogma. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2006;216:493–504. doi: 10.1016/j.taap.2006.06.009. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 7. Galie M., Covi V., Tabaracci G., Malatesta M. The Role of Nrf2 in the Antioxidant Cellular Response to Medical Ozone Exposure. Int. J. Mol. Sci. 2019;20:4009. doi: 10.3390/ijms20164009. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 8. Hakiminia B., Goudarzi A., Moghaddas A. Has vitamin E any shreds of evidence in cisplatin-induced toxicity. J. Biochem. Mol. Toxicol. 2019;33:e22349. doi: 10.1002/jbt.22349. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 9. Pabla N., Dong Z. Cisplatin nephrotoxicity: Mechanisms and renoprotective strategies. Kidney Int. 2008;73:994–1007. doi: 10.1038/sj.ki.5002786. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 10. Dugbartey G.J., Peppone L.J., de Graaf I.A. An integrative view of cisplatin-induced renal and cardiac toxicities: Molecular mechanisms, current treatment challenges and potential protective measures. Toxicology. 2016;371:58–66. doi: 10.1016/j.tox.2016.10.001. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 11. Howard S.C., McCormick J., Pui C.H., Buddington R.K., Harvey R.D. Preventing and Managing Toxicities of High-Dose Methotrexate. Oncologist. 2016;21:1471–1482. doi: 10.1634/theoncologist.2015-0164. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 12. Wessels J.A., Huizinga T.W., Guchelaar H.J. Recent insights in the pharmacological actions of methotrexate in the treatment of rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford) 2008;47:249–255. doi: 10.1093/rheumatology/kem279. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 13. Miyazono Y., Gao F., Horie T. Oxidative stress contributes to methotrexate-induced small intestinal toxicity in rats. Scand. J. Gastroenterol. 2004;39:1119–1127. doi: 10.1080/00365520410003605. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 14. Mahmoud A.M., Hussein O.E., Hozayen W.G., Abd El-Twab S.M. Methotrexate hepatotoxicity is associated with oxidative stress, and down-regulation of PPARgamma and Nrf2: Protective effect of 18beta-Glycyrrhetinic acid. Chem. Biol. Interact. 2017;270:59–72. doi: 10.1016/j.cbi.2017.04.009. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 15. Pugazhendhi A., Edison T., Velmurugan B.K., Jacob J.A., Karuppusamy I. Toxicity of Doxorubicin (Dox) to different experimental organ systems. Life Sci. 2018;200:26–30. doi: 10.1016/j.lfs.2018.03.023. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 16. Luo X., Evrovsky Y., Cole D., Trines J., Benson L.N., Lehotay D.C. Doxorubicin-induced acute changes in cytotoxic aldehydes, antioxidant status and cardiac function in the rat. Biochim. Biophys. Acta. 1997;1360:45–52. [PubMed] [Google Scholar]
• 17. Sikic B.I. Biochemical and cellular determinants of bleomycin cytotoxicity. Cancer Surv. 1986;5:81–91. [PubMed] [Google Scholar]
• 18. Yu Z., Yan B., Gao L., Dong C., Zhong J., DOrtenzio M., Nguyen B., Seong Lee S., Hu X., Liang F. Targeted Delivery of Bleomycin: A Comprehensive Anticancer Review. Curr. Cancer Drug Targets. 2016;16:509–521. doi: 10.2174/1568009616666151130213910. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 19. Shariati S., Kalantar H., Pashmforoosh M., Mansouri E., Khodayar M.J. Epicatechin protective effects on bleomycin-induced pulmonary oxidative stress and fibrosis in mice. Biomed. Pharmacother. 2019;114:108776. doi: 10.1016/j.biopha.2019.108776. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 20. Chen W., Li S., Li J., Zhou W., Wu S., Xu S., Cui K., Zhang D.D., Liu B. Artemisitene activates the Nrf2-dependent antioxidant response and protects against bleomycin-induced lung injury. FASEB J. 2016;30:2500–2510. doi: 10.1096/fj.201500109R. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 21. Bocci V., Borrelli E., Travagli V., Zanardi I. The ozone paradox: Ozone is a strong oxidant as well as a medical drug. Med. Res. Rev. 2009;29:646–682. doi: 10.1002/med.20150. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 22. Bocci V.A., Zanardi I., Travagli V. Ozone acting on human blood yields a hormetic dose-response relationship. J. Transl. Med. 2011;9:66. doi: 10.1186/1479-5876-9-66. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 23. Viebahn-Hansler R., Leon Fernandez O.S., Fahmy Z. Ozone in Medicine: The Low-Dose Ozone Concept—Guidelines and Treatment Strategies. Ozone-Sci. Eng. 2012;34:408–424. doi: 10.1080/01919512.2012.717847. [CrossRef] [Google Scholar]
• 24. Re L., Malcangi G., Martínez-Sánchez G. Medical ozone is now ready for a scientific challenge: Current status and future perspectives. J. Exp. Integr. Med. 2012;2:193–196. doi: 10.5455/jeim.070612.ir.012. [CrossRef] [Google Scholar]
• 25. Hamilton R.F., Jr., Li L., Eschenbacher W.L., Szweda L., Holian A. Potential involvement of 4-hydroxynonenal in the response of human lung cells to ozone. Am. J. Physiol. 1998;274 (Pt 1):L8–L16. doi: 10.1152/ajplung.1998.274.1.L8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 26. Pryor W.A., Squadrito G.L., Friedman M. The cascade mechanism to explain ozone toxicity: The role of lipid ozonation products. Free Radic. Biol. Med. 1995;19:935–941. doi: 10.1016/0891-5849(95)02033-7. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 27. Pecorelli A., Bocci V., Acquaviva A., Belmonte G., Gardi C., Virgili F., Ciccoli L., Valacchi G. NRF2 activation is involved in ozonated human serum upregulation of HO-1 in endothelial cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2013;267:30–40. doi: 10.1016/j.taap.2012.12.001. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 28. Oliveira-Marques V., Marinho H.S., Cyrne L., Antunes F. Role of hydrogen peroxide in NF-kappaB activation: From inducer to modulator. Antioxid. Redox Signal. 2009;11:2223–2243. doi: 10.1089/ars.2009.2601. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 29. Huth K.C., Saugel B., Jakob F.M., Cappello C., Quirling M., Paschos E., Ern K., Hickel R., Brand K. Effect of aqueous ozone on the NF-kappaB system. J. Dent. Res. 2007;86:451–456. doi: 10.1177/154405910708600512. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 30. Kafoury R.M., Hernandez J.M., Lasky J.A., Toscano W.A., Jr., Friedman M. Activation of transcription factor IL-6 (NF-IL-6) and nuclear factor-kappaB (NF-kappaB) by lipid ozonation products is crucial to interleukin-8 gene expression in human airway epithelial cells. Environ. Toxicol. 2007;22:159–168. doi: 10.1002/tox.20246. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 31. Wang L., Chen Z., Liu Y., Du Y., Liu X. Ozone oxidative postconditioning inhibits oxidative stress and apoptosis in renal ischemia and reperfusion injury through inhibition of MAPK signaling pathway. Drug Des. Devel. Ther. 2018;12:1293–1301. doi: 10.2147/DDDT.S164927. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 32. Galie M., Costanzo M., Nodari A., Boschi F., Calderan L., Mannucci S., Covi V., Tabaracci G., Malatesta M. Mild ozonisation activates antioxidant cell response by the Keap1/Nrf2 dependent pathway. Free Radic. Biol. Med. 2018;124:114–121. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2018.05.093. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 33. Siniscalco D., Trotta M.C., Brigida A.L., Maisto R., Luongo M., Ferraraccio F., D’Amico M., Di Filippo C. Intraperitoneal Administration of Oxygen/Ozone to Rats Reduces the Pancreatic Damage Induced by Streptozotocin. Biology (Basel) 2018;7:10. doi: 10.3390/biology7010010. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 34. Nakasone M., Nakaso K., Horikoshi Y., Hanaki T., Kitagawa Y., Takahashi T., Inagaki Y., Matsura T. Preconditioning by Low Dose LPS Prevents Subsequent LPS-Induced Severe Liver Injury via Nrf2 Activation in Mice. Yonago Acta Med. 2016;59:223–231. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 35. Ayala A., Munoz M.F., Arguelles S. Lipid peroxidation: Production, metabolism, and signaling mechanisms of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal. Oxid. Med. Cell Longev. 2014;2014:360438. doi: 10.1155/2014/360438. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 36. Breitzig M., Bhimineni C., Lockey R., Kolliputi N. 4-Hydroxy-2-nonenal: A critical target in oxidative stress? Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2016;311:C537–C543. doi: 10.1152/ajpcell.00101.2016. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 37. Re L., Martínez-Sánchez G., Bordicchia M., Malcangi G., Pocognoli A., Angel Morales-Segura M., Rothchild J., Rojas A. Is ozone pre-conditioning effect linked to Nrf2/EpRE activation pathway in vivo? A preliminary result. Eur. J. Pharmacol. 2014;742:158–162. doi: 10.1016/j.ejphar.2014.08.029. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 38. Delgado-Roche L., Riera-Romo M., Mesta F., Hernandez-Matos Y., Barrios J.M., Martinez-Sanchez G., Al-Dalaien S.M. Medical ozone promotes Nrf2 phosphorylation reducing oxidative stress and pro-inflammatory cytokines in multiple sclerosis patients. Eur. J. Pharmacol. 2017;811:148–154. doi: 10.1016/j.ejphar.2017.06.017. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 39. Ahmed S.M., Luo L., Namani A., Wang X.J., Tang X. Nrf2 signaling pathway: Pivotal roles in inflammation. Biochim. Biophys. Acta Mol. Basis Dis. 2017;1863:585–597. doi: 10.1016/j.bbadis.2016.11.005. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 40. Ganesh Yerra V., Negi G., Sharma S.S., Kumar A. Potential therapeutic effects of the simultaneous targeting of the Nrf2 and NF-kappaB pathways in diabetic neuropathy. Redox Biol. 2013;1:394–397. doi: 10.1016/j.redox.2013.07.005. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 41. Mohan S., Gupta D. Crosstalk of toll-like receptors signaling and Nrf2 pathway for regulation of inflammation. Biomed. Pharmacother. 2018;108:1866–1878. doi: 10.1016/j.biopha.2018.10.019. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 42. Wardyn J.D., Ponsford A.H., Sanderson C.M. Dissecting molecular cross-talk between Nrf2 and NF-kappaB response pathways. Biochem. Soc. Trans. 2015;43:621–626. doi: 10.1042/BST20150014. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 43. Yu G., Liu X., Chen Z., Chen H., Wang L., Wang Z., Qiu T., Weng X. Ozone therapy could attenuate tubulointerstitial injury in adenine-induced CKD rats by mediating Nrf2 and NF-kappaB. Iran. J. Basic Med. Sci. 2016;19:1136–1143. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 44. Borrego A., Zamora Z.B., Gonzalez R., Romay C., Menendez S., Hernandez F., Montero T., Rojas E. Protection by ozone preconditioning is mediated by the antioxidant system in cisplatin-induced nephrotoxicity in rats. Mediators Inflamm. 2004;13:13–19. doi: 10.1080/09629350410001664806. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 45. Gonzalez R., Borrego A., Zamora Z., Romay C., Hernandez F., Menendez S., Montero T., Rojas E. Reversion by ozone treatment of acute nephrotoxicity induced by cisplatin in rats. Mediators Inflamm. 2004;13:307–312. doi: 10.1080/09629350400008836. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 46. Borrego A., Zamora Z.B., Gonzalez R., Romay C., Menendez S., Hernandez F., Berlanga J., Montero T. Ozone/oxygen mixture modifies the subcellular redistribution of Bax protein in renal tissue from rats treated with cisplatin. Arch. Med. Res. 2006;37:717–722. doi: 10.1016/j.arcmed.2006.02.008. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 47. Sheikh-Hamad D., Cacini W., Buckley A.R., Isaac J., Truong L.D., Tsao C.C., Kishore B.K. Cellular and molecular studies on cisplatin-induced apoptotic cell death in rat kidney. Arch. Toxicol. 2004;78:147–155. doi: 10.1007/s00204-003-0521-4. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 48. Redza-Dutordoir M., Averill-Bates D.A. Activation of apoptosis signalling pathways by reactive oxygen species. Biochim. Biophys. Acta. 2016;1863:2977–2992. doi: 10.1016/j.bbamcr.2016.09.012. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 49. Shiraishi F., Curtis L.M., Truong L., Poss K., Visner G.A., Madsen K., Nick H.S., Agarwal A. Heme oxygenase-1 gene ablation or expression modulates cisplatin-induced renal tubular apoptosis. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2000;278:F726–F736. doi: 10.1152/ajprenal.2000.278.5.F726. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 50. Bolisetty S., Traylor A., Joseph R., Zarjou A., Agarwal A. Proximal tubule-targeted heme oxygenase-1 in cisplatin-induced acute kidney injury. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2016;310:F385–F394. doi: 10.1152/ajprenal.00335.2015. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 51. Bocci V., Valacchi G. Nrf2 activation as target to implement therapeutic treatments. Front. Chem. 2015;3:4. doi: 10.3389/fchem.2015.00004. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 52. Kocak H.E., Taskin U., Aydin S., Oktay M.F., Altinay S., Celik D.S., Yucebas K., Altas B. Effects of ozone (O3) therapy on cisplatin-induced ototoxicity in rats. Eur. Arch. Otorhinolaryngol. 2016;273:4153–4159. doi: 10.1007/s00405-016-4104-4. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 53. Kesik V., Uysal B., Kurt B., Kismet E., Koseoglu V. Ozone ameliorates methotrexate-induced intestinal injury in rats. Cancer Biol. Ther. 2009;8:1623–1628. doi: 10.4161/cbt.8.17.9203. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 54. Aslaner A., Cakir T., Celik B., Dogan U., Mayir B., Akyuz C., Polat C., Basturk A., Soyer V., Koc S., et al. Does intraperitoneal medical ozone preconditioning and treatment ameliorate the methotrexate induced nephrotoxicity in rats? Int. J. Clin. Exp. Med. 2015;8:13811–13817. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 55. Aslaner A., Cakir T., Celik B., Dogan U., Akyuz C., Basturk A., Polat C., Gunduz U., Mayir B., Sehirli A.O. The protective effect of intraperitoneal medical ozone preconditioning and treatment on hepatotoxicity induced by methotrexate. Int. J. Clin. Exp. Med. 2015;8:13303–13309. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 56. Leon Fernandez O.S., Viebahn-Haensler R., Cabreja G.L., Espinosa I.S., Matos Y.H., Roche L.D., Santos B.T., Oru G.T., Polo Vega J.C. Medical ozone increases methotrexate clinical response and improves cellular redox balance in patients with rheumatoid arthritis. Eur. J. Pharmacol. 2016;789:313–318. doi: 10.1016/j.ejphar.2016.07.031. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 57. Delgado-Roche L., Hernandez-Matos Y., Medina E.A., Morejon D.A., Gonzalez M.R., Martinez-Sanchez G. Ozone-Oxidative Preconditioning Prevents Doxorubicin-induced Cardiotoxicity in Sprague-Dawley Rats. Sultan Qaboos Univ. Med. J. 2014;14:e342–e348. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
• 58. Calunga Fernández J.L., Bello Ferro M., Chaple La Hoz M., Barber Gutierrez E., Menendez Cepero S., Merino N. Ozonoterapia en la glomerulonefritis tóxica experimental por adriamicina. Rev. Cubana Investig. Biomed. 2004;23:139–143. [Google Scholar]
• 59. Kesik V., Yuksel R., Yigit N., Saldir M., Karabacak E., Erdem G., Babacan O., Gulgun M., Korkmazer N., Bayrak Z. Ozone Ameliorates Doxorubicine-Induced Skin Necrosis – results from an animal model. Int. J. Low Extrem. Wounds. 2016;15:248–254. doi: 10.1177/1534734615597863. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 60. Salem E.A., Salem N.A., Hellstrom W.J. Therapeutic effect of ozone and rutin on adriamycin-induced testicular toxicity in an experimental rat model. Andrologia. 2017;49:e12603. doi: 10.1111/and.12603. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 61. Kamble S.M., Patil C.R. Asiatic Acid Ameliorates Doxorubicin-Induced Cardiac and Hepato-Renal Toxicities with Nrf2 Transcriptional Factor Activation in Rats. Cardiovasc Toxicol. 2018;18:131–141. doi: 10.1007/s12012-017-9424-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 62. Santana-Rodriguez N., Santisteban P.L., Clavo B., Camacho R., Santana C., Fiuza M.D. Protective effect of ozone in an experimental model of pulmonary fibrosis. Br. J. Surg. 2015;102:11. [Google Scholar]
• 63. Menendez Cepero S., Gonzalez Alvarez R., Ledea Lozano O.E., Hernandez Rosales F., Leon Fernandez O.S., Diaz Gomez M. Ozono, Aspectos Básicos y Aplicaciones Clínicas. Centro de Investigaciones del Ozono; La Habana, Cuba: 2008. [Google Scholar]
• 64. Borrelli E. Treatment of advanced non-small-cell lung cancer with oxygen ozone therapy and mistletoe: An integrative approach. Eur. J. Integr. Med. 2012;4:130. [Google Scholar]
• 65. Velasco R., Bruna J. Chemotherapy-induced peripheral neuropathy: An unresolved issue. Neurologia. 2010;25:116–131. doi: 10.1016/S0213-4853(10)70036-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 66. Velasco R., Santos C., Soler G., Gil-Gil M., Pernas S., Galan M., Palmero R., Bruna J. Serum micronutrients and prealbumin during development and recovery of chemotherapy-induced peripheral neuropathy. J. Peripher. Nerv. Syst. 2016;21:134–141. doi: 10.1111/jns.12177. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 67. Starobova H., Vetter I. Pathophysiology of Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. Front. Mol. Neurosci. 2017;10:174. doi: 10.3389/fnmol.2017.00174. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 68. Albers J.W., Chaudhry V., Cavaletti G., Donehower R.C. Interventions for preventing neuropathy caused by cisplatin and related compounds. Cochrane Database Syst. Rev. 2014;3:CD005228. doi: 10.1002/14651858.CD005228.pub4. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 69. Hershman D.L., Lacchetti C., Dworkin R.H., Lavoie Smith E.M., Bleeker J., Cavaletti G., Chauhan C., Gavin P., Lavino A., Lustberg M.B., et al. Prevention and management of chemotherapy-induced peripheral neuropathy in survivors of adult cancers: American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline. J. Clin. Oncol. 2014;32:1941–1967. doi: 10.1200/JCO.2013.54.0914. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 70. Clavo B. Ozone therapy in the management of side effects related to cancer treatments; Proceedings of the 2nd International Traditional and Complementary Medicine Congress (Organized with technical sponsorship of the World Health Organization); Istanbul, Turkey. 24 April 2019. [Google Scholar]
• 71. Bakkal B.H., Gultekin F.A., Guven B., Turkcu U.O., Bektas S., Can M. Effect of ozone oxidative preconditioning in preventing early radiation-induced lung injury in rats. Braz J. Med. Biol. Res. 2013;46:789–796. doi: 10.1590/1414-431X20132856. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 72. Gultekin F.A., Bakkal B.H., Guven B., Tasdoven I., Bektas S., Can M., Comert M. Effects of ozone oxidative preconditioning on radiation-induced organ damage in rats. J. Radiat. Res. 2013;54:36–44. doi: 10.1093/jrr/rrs073. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 73. Menendez S., Cepero J., Borrego L.R. Ozone therapy in cancer treatment: State of the art. Ozone Sci. Eng. 2008;30:398–404. doi: 10.1080/01919510802473724. [CrossRef] [Google Scholar]
• 74. Clavo B., Ceballos D., Gutierrez D., Rovira G., Suarez G., Lopez L., Pinar B., Cabezon A., Morales V., Oliva E., et al. Long-term control of refractory hemorrhagic radiation proctitis with ozone therapy. J. Pain Symptom Manag. 2013;46:106–112. doi: 10.1016/j.jpainsymman.2012.06.017. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 75. Clavo B., Santana-Rodriguez N., Llontop P., Gutierrez D., Ceballos D., Mendez C., Rovira G., Suarez G., Rey-Baltar D., Garcia-Cabrera L., et al. Ozone Therapy in the Management of Persistent Radiation-Induced Rectal Bleeding in Prostate Cancer Patients. Evid. Based Complement. Alternat. Med. 2015;2015:480369. doi: 10.1155/2015/480369. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 76. Milkovic L., Zarkovic N., Saso L. Controversy about pharmacological modulation of Nrf2 for cancer therapy. Redox Biol. 2017;12:727–732. doi: 10.1016/j.redox.2017.04.013. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 77. Zhong H., Yin H. Role of lipid peroxidation derived 4-hydroxynonenal (4-HNE) in cancer: Focusing on mitochondria. Redox Biol. 2015;4:193–199. doi: 10.1016/j.redox.2014.12.011. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 78. Allen B.G., Bhatia S.K., Buatti J.M., Brandt K.E., Lindholm K.E., Button A.M., Szweda L.I., Smith B.J., Spitz D.R., Fath M.A. Ketogenic diets enhance oxidative stress and radio-chemo-therapy responses in lung cancer xenografts. Clin. Cancer Res. 2013;19:3905–3913. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-12-0287. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 79. DiDonato J.A., Mercurio F., Karin M. NF-kappaB and the link between inflammation and cancer. Immunol. Rev. 2012;246:379–400. doi: 10.1111/j.1600-065X.2012.01099.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 80. Garg A., Aggarwal B.B. Nuclear transcription factor-kappaB as a target for cancer drug development. Leukemia. 2002;16:1053–1068. doi: 10.1038/sj.leu.2402482. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 81. El-Deek H.E.M., Ahmed A.M., Mohammed R.A.A. Aberration of Nrf2Bach1 pathway in colorectal carcinoma; role in carcinogenesis and tumor progression. Ann. Diagn. Pathol. 2019;38:138–144. doi: 10.1016/j.anndiagpath.2018.11.003. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 82. Rocha C.R., Kajitani G.S., Quinet A., Fortunato R.S., Menck C.F. NRF2 and glutathione are key resistance mediators to temozolomide in glioma and melanoma cells. Oncotarget. 2016;7:48081–48092. doi: 10.18632/oncotarget.10129. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 83. Zheng H., Nong Z., Lu G. Correlation Between Nuclear Factor E2-Related Factor 2 Expression and Gastric Cancer Progression. Med. Sci. Monit. 2015;21:2893–2899. doi: 10.12659/MSM.894467. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 84. Rojo de la Vega M., Chapman E., Zhang D.D. NRF2 and the Hallmarks of Cancer. Cancer Cell. 2018;34:21–43. doi: 10.1016/j.ccell.2018.03.022. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 85. Yasueda A., Urushima H., Ito T. Efficacy and Interaction of Antioxidant Supplements as Adjuvant Therapy in Cancer Treatment: A Systematic Review. Integr. Cancer Ther. 2016;15:17–39. doi: 10.1177/1534735415610427. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 86. Conklin K.A. Chemotherapy-associated oxidative stress: Impact on chemotherapeutic effectiveness. Integr. Cancer Ther. 2004;3:294–300. doi: 10.1177/1534735404270335. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• 87. Clavo B., Santana-Rodriguez N., Llontop P., Gutierrez D., Suarez G., Lopez L., Rovira G., Martinez-Sanchez G., Gonzalez E., Jorge I.J., et al. Ozone Therapy as Adjuvant for Cancer Treatment: Is Further Research Warranted? Evid. Based Complement. Alternat. Med. 2018;2018:7931849. doi: 10.1155/2018/7931849. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]